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組織/細胞裂解液重要特點以及選擇指南(MKBIO)
時間:2018-10-04     作者:懋康原創     文章來源:懋康生物    


 

前言:

在免疫印跡(WB)、免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(Co-IP),以及染色質免疫沉淀(ChIP)等許多研究組織或細胞內蛋白表達,蛋白純化以及蛋白-蛋白、蛋白-核酸間互作的各種免疫實驗內,首先要做的第一步就是進行組織(細胞)裂解,通過破壞細胞膜或細胞核膜的屏障,將要待研究的對象釋放到體外環境中。為此,擁有合適的組織/細胞裂解液是開展實驗重要的一環。

 

針對各種下游實驗的特點,懋康生物(MKBio)提供幾種常見的組織/細胞裂解液,基本涵蓋用戶需求。

 

總表:各種組織/細胞裂解液主要特點和應用差異(MKBIO)

產品

貨號

MP1501

MP1502

MP1503

MP1504

MP1505

MP1506

MP1507

MP1508

產品

名稱

RIPA裂解液(強)

RIPA裂解液(中)

RIPA裂解液(弱)

WB/IP裂解液

NP-40裂解液

SDS裂解液

RIPA裂解液(強,無抑制劑)

WB/IP裂解液(無抑制劑)

有效裂解成分

1% Triton X-100,1%脫氧膽酸鈉,0.1% SDS

1% NP-40,0.5%脫氧膽酸鈉,0.1% SDS

1% NP-40,0.25%脫氧膽酸鈉

1% Triton X-100

1% NP-40

1% SDS

1% Triton X-100,1%脫氧膽酸鈉,0.1% SDS

1% Triton X-100

裂解強度

溫和

溫和

溫和

溫和

對膜蛋白的提取

很好

較好

一般

一般

一般

很好

很好

一般

對胞漿蛋白的提取

很好

很好

很好

很好

很好

很好

很好

很好

對核蛋白的提取

很好

較好

較好

較好

較好

很好

很好

較好

胞漿磷酸化蛋白提取

很好

很好

很好

很好

很好

很好

很好

很好

核轉錄因子提取

很好

很好

很好

很好

很好

很好

很好

很好

蛋白酶抑制劑

含有

含有

含有

含有

含有

含有

不含

不含

磷酸酶抑制劑

含有

含有

含有

含有

含有

含有

不含

不含

主要用途

WB,IP

WB,IP

WB,IP,Co-IP

WB,IP,Co-IP

WB,IP,Co-IP

WB,ChIP

WB,IP

WB,IP,Co-IP


組織/細胞裂解液選擇說明:

a)   對于普通的WB,IP,Co-IP,推薦使用WB/IP裂解液(# MP1504-100ML),經此裂解所得的產物沒有非常粘滯的透明狀DNA團塊形成,不必采用超聲處理等就可以非常理想地用于后續操作。另外,此裂解液裂解的產物也適合用于磷酸化蛋白的WB檢測。

b)   對于某些特殊蛋白的IP,如果WB/IP裂解液(# MP1504-100ML)效果不理想,可嘗試用RIPA(強,中,弱)或NP-40裂解液。若發現IP背景很高,說明非特異性蛋白被沉淀下來,則需選用裂解強度較高的裂解液,如RIPA(強或中)。如果發現目的蛋白無法被沉淀下來,說明裂解液的強度過強,可使用較溫和的裂解液如RIPA(弱)或NP-40裂解液。

c)   對于某些難溶解蛋白的WB,如果WB/IP裂解液(# MP1504-100ML)效果不理想,可嘗試使用裂解強度更高的裂解液如RIPA(強,中)或SDS裂解液。

d)   對于特定用途需要自行添加特定抑制劑或不需添加抑制劑,可考慮選擇RIPA裂解液(強,無抑制劑)(# MP1507-100ML)或WB/IP裂解液(無抑制劑)(# MP1508-100ML),后者很多情況下兼容酶活性和生物小分子的檢測,具體兼容性如何請自行測試,我司無相應數據提供。

 

補充知識點

一、 關于去垢劑(detergents

1.1   去垢劑的分類

幾種組織/細胞裂解液裂解強度(應用)的差異主要還是配方中去污劑種類和濃度的不同。去污劑分為變性去污劑(denaturing detergents)和非變性去污劑(non-denaturing detergents),前者可以是陰離子比如SDS,或陽離子比如乙基三甲基溴化銨,這些去垢劑總體來說破壞膜和通過打破蛋白-蛋白間相互作用來變性蛋白;非變性去垢劑分為非離子比如Triton X-100,膽鹽比如膽酸鹽類和兩性離子去垢劑比如CHAPS。


1.2   常見去垢劑(用于蛋白增溶)的特征

去垢劑

類型

聚集數

膠束分子量

臨界膠束濃度(CMC, mM)

臨界膠束濃度(CMC, %,w/v)

濁點(℃)

透析去除

Triton X-100

非離子型

140

90,000

0.24

0.0155

64

Triton X-114

非離子型

/

/

0.21

0.0113

23

NP-40

非離子型

149

90,000

0.29

0.0179

80

Brij-35

非離子型

40

49,000

0.09

0.1103

>100

Brij-58

非離子型

70

82,000

0.077

0.0086

>100

Tween-20

非離子型

/

/

0.06

0.0074

95

Tween-80

非離子型

60

76,000

0.012

0.0016

/

 

Octyl Glucoside

非離子型

27

8,000

23-25

0.6716-0.7300

/

Octylthio Glucoside

非離子型

/

/

9

0.2772

>100

SDS

陰離子

62

18,000

288

6-8

0.1728-2304

CHAPS

兩性離子

10

6,149

8-10

0.4920-0.6150

>100

CHAPSO

兩性離子

11

6,940

8-10

0.5048

90

 

二、 幾個免疫實驗的基本概念

免疫印跡(Immunoblotting):又稱蛋白質印跡(Western blotting),是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性,現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進行定性和半定量分析。結合化學發光檢測,可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。

 

免疫沉淀(Immunoprecipitation):是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法??贵w與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后,再與蛋白A/G或二抗偶聯的agarose或Sepharose珠子孵育,通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復合物,沉淀經過洗滌后,重懸于電泳上樣緩沖液,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,離心收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。 

 

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation):是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。當用預先固化在argarose beads上的蛋白質A的抗體免疫沉淀A蛋白,那么與A蛋白在體內結合的蛋白質B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離,對B蛋白進行檢測,進而證明兩者間的相互作用。

 

染色質免疫共沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP):是一種適用于研究蛋白質與生物體細胞中 DNA 相互作用的經典方法,這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾 。檢測原理是當在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA 復合物,并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然后通過免疫學方法沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的 DNA 片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與 DNA 相互作用的信息。

 

 

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

 

 

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學和生物技術領域研究的試劑、儀器和實驗室消耗品與實驗服務工作,主要從事細胞生物學、植物學、分子生物學、免疫學、生物化學、蛋白組學。生物制藥與診斷試劑研發生產等領域。 本公司秉承“以人為本,以誠為信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為廣大客戶提供優質產品。


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