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活體成像研究底物之:Coelenterazine 腔腸素
時間:2017-11-16     作者:懋康原創     文章來源:懋康生物    

活體成像研究底物之:

Coelenterazine 腔腸素(Rluc/Gluc報告基因)

— —活體成像研究/體外生物發光研究

     

搜索關鍵詞:

Rluc 報告基因;Renilla Luciferase 海腎熒光素酶;Coelenterazine 腔腸素;D-Luciferin Sodium D-螢火蟲熒光素鈉鹽;In vivo imaging 活體成像研究;雙熒光素酶報告基因檢測;CAS:55779-48-1;

 

基本描述:

腔腸素(Coelenterazine)是在水生生物中發現的一種發光基團(luminophore),是許多熒光素酶的作用底物,包括海腎熒光素酶(Renilla reniformis luciferase, Rluc),分泌型膜錨定熒光素酶(Gaussia luciferase, Gluc)和藪枝蟲熒光素酶(Obelia luciferase),和發光蛋白包括水母發光蛋白(Aequorin)的構成之一。前者的作用原理是以腔腸素為底物的熒光素酶,在含分子氧的條件下,氧化腔腸素產生高能量的中間產物,在此過程發射藍色光,光波長在450~480nm。不同于甲蟲(或螢火蟲)熒光素/熒光素酶(FLuc)系統不同,在含分子氧的條件下,還需要ATP和Mg2+的存在才能同時發光,光波長在550-570nm。由于生物發光信號和底物的差異,RLuc常常與FLuc聯合用于多報告基因研究。后者的作用原理是由脫輔基水母發光蛋白(Apoaequorin, APO),分子氧和腔腸素組成的復合物形成活化的水母發光蛋白(Aequorin),一旦與鈣離子結合后,復合物結構被破壞,腔腸素被氧化生成高能產物(Coelenteramide),同時釋放出CO2和藍色光。


腔腸素應用甚是廣泛,包括:1)活細胞或組織的鈣離子檢測;2)細胞或組織的超氧化物和過氧亞硝基陰離子(活性氧,ROS)化學發光檢測;3)基因報告基因檢測;4)動物活體檢測;5)ELISA和生物發光共振能量轉移(BRET)用于蛋白相互作用研究;6)藥物高通量篩選(HTS);

 

腔腸素的幾個重要應用:

A、腔腸素/水母蛋白復合物用于鈣離子檢測(Coelenterazine/aequorin complex for calcium measurement)

A1、與傳統熒光法鈣離子濃度檢測的優勢

傳統熒光法鈣離子檢測工具琳瑯滿目,由紫外光激發到可見光激發的鈣離子檢測,比如,Fura-2激發光比率型熒光探針,Fluo-8最亮的鈣離子熒光探針,鈣離子檢測的靈敏度越來越高,也越來越方便,對儀器的要求也越來越低,那么腔腸素/水母蛋白系統對鈣離子檢測的優勢在哪呢?

○ 鈣離子/水母蛋白復合物(Ca2+/aequorin complex)能檢測寬廣范圍的鈣離子濃度,從~0.1μM到>100μM。

○ 比熒光法探針的背景低,樣本本身不會發生自熒光。

○ 雖然信號比熒光法低,但用成像儀能得到更高的信噪比。

○ 水母蛋白復合物(aequorin complex)不會從細胞內泄露出來,因此能監測幾小時至數天內細胞鈣離子(Ca2+)濃度變化。


A2、工作原理

由脫輔基水母發光蛋白(Apoaequorin, APO),分子氧和腔腸素組成的復合物形成活化的水母發光蛋白(Aequorin),一旦與鈣離子結合后,復合物結構被破壞,腔腸素被氧化生成高能產物(Coelenteramide),同時釋放出CO2和藍色光(~466nm)。

 


圖1. 腔腸素/水母蛋白復合物用于鈣離子檢測的反應流程。

 

B、生物共振能量轉移(BRET for assaying protein-protein interactions)

B1、工作原理

BRET是一種高級的、無破壞性和以細胞為基礎的檢測技術,極其適合蛋白組學研究,包括受體研究和信號轉導途徑的路線圖。該技術是基于含生物發光熒光素酶和GFP變體融合蛋白之間的非放射性能量轉移。

大部分應用中融合供體是海腎熒光素酶(RLuc),而不是水母發光蛋白(Aequorin),目的是為了避免對水母來源GFP突變蛋白的內源性親和性。受體是黃色熒光蛋白(YFP),能夠提高良種發射光間的光譜區分。當供體和受體靠近,對腔腸素衍生物底物催化降解后產生的能量從熒光素酶轉移到YFP,從而使其釋放自身的熒光。BRET比值的計算顯示體內是否存在蛋白-蛋白相互作用,這種檢測方法有效去除光輸出波動可能造成數據的變動,比如由于反應體積、細胞類型、每孔細胞數目和/孔間信號延誤等引起光輸出波動。


B2、BRET與FRET相比的優勢

熒光共振能量轉移(FRET),生物發光供體被第二種熒光素所替代,其發射光譜與受體熒光素的激發光譜重疊。與FRET相比,BRET的主要優勢在于:沒有光淬滅或供體蛋白的光異構化,對細胞無光損傷,無光散射,或細胞或酶標板的自發熒光。因沒有受體直接激發引起的光發射,BRET背景更低,允許檢測更低濃度蛋白間的相互作用。

 

C、報告基因檢測(Rluc as a reporter gene)

海腎熒光素酶(Rluc)用作報告基因以研究體內外的基因調控和功能,普遍用于多重轉錄報告基因檢測或用作熒光蟲熒光素酶轉染的內參。

工作原理如下:海腎熒光素酶(RLuc),分子量為36kDa的單體蛋白,在氧氣的作用下氧化腔腸素生成熒光(見圖2)。Rluc不需要通過后期的翻譯加工來獲得活性,只需要翻譯后就能用作基因報告子。

圖2. 海腎熒光素酶(Rluc)催腔腸素發光的反應流程

 

我司(懋康生物Maokangbio)提供天然腔腸素以及幾種腔腸素衍生物,它們對鈣離子的親和力,光譜特性,以及應用傾向上會有差異,詳見表1—天然腔腸素及其衍生物的光譜特性,表2—天然腔腸素及其衍生物的應用差異選擇適當的產品。

表1 – 天然腔腸素及其衍生物的光譜特性

產品名稱

貨號

Em (nm)

RLC1

Relative Intensity2

Half-rise time (ms)3

Coelenterazine native

MX4606       

466             

1.00            

1

6-30

Coelenterazine h

MX4607

466

0.75

16

6-30

Coelenterazine 400 a

MX4610

400

/

/

/

Coelenterazine hcp

MX4614

445

0.65

500

2-5

Coelenterazine cp

MX4613

442

0.63

28

2-5

Coelenterazine f

MX4612

472

0.80

20

6-30

Coelenterazine n

MX4615

468

0.25

0.15

6-30

Coelenterazine e

MX4611

405& 465

0.5

4

0.15-0.3

[1] RLC = relative luminescence capacity: Total time-integrated emission of aequorin in saturating Ca2+relative to native aequorin = 1.0. 

[2] Ratio of the luminescence of aequorin reconstituted with coelenterazine analog relative to native aequorin at 100 nM Ca2+.

[3] Half-Rise Time: The half-rise time is the time for the luminescence signal to reach 50% of the maximum after addition of 1 mM Ca2+to a standard of aequorin reconstituted with the coelenterazine analog of interest.

All data are from O. Shimomura in Cell Calcium 14, 373 (1993).

 

表2 – 天然腔腸素及其衍生物的應用差異

產品名稱

貨號

應用特征

Coelenterazine native

MX4606

應用非常廣泛的標準底物。腔腸素是天然水母發光蛋白復合物的發光基團,也是海腎熒光素酶(Rluc)的底物。底物的快速再生(fast regeneration)比較重要的實驗推薦使用天然腔腸素。

1)生物發光檢測鈣離子的靈敏度非常高,檢測范圍從0.1μM到>100μM;2)使用腔腸素監測報告基因表達是其主要應用;3)其他應用包括生物共振能量轉移BRET,化學發光檢測細胞或組織內的超氧陰離子和過氧化亞硝基陰離子水平(ROS);

Coelenterazine h                       

MX4607             

1)腔腸素h形成的水母發光蛋白復合物比天然腔腸素復合物的光強度高10倍以上;2)比天然腔腸素對鈣離子敏感度更高;3)也適用報告基因分析。

Coelenterazine 400 a

MX4610

也稱為DeepBlue C,是一種腔腸素衍生物,用作海腎熒光素酶Rluc的底物,發射峰約400nm。含GFP受體的BRET研究是Rluc的首選底物,因其對GFP受體的發射波干擾非常小。不可用作Gluc底物。

Coelenterazine hcp

MX4614

其生物發光強度最高(腔腸素hcp形成水母發光蛋白復合物的熒光強度比天然腔腸素復合物高190倍),對Ca2+反應速度快。

Coelenterazine cp

MX4613

Coelenterazine cp產生水母發光蛋白復合物的光強度是天然腔腸素復合物的15倍,且具有更快的Ca2+反應性。

Coelenterazine f

MX4612

腔腸素f形成的水母發光蛋白復合物的光強度是天然腔腸素復合物的20倍,最大發射波長約長8nm。具有最好的細胞滲透性。當需要具極高鈣離子Ca2+靈敏度的水母發光蛋白復合物,建議用腔腸素f。

Coelenterazine n

MX4615

所有的腔腸素衍生物中熒光強度最弱,對Ca2+反應時間明顯慢于天然腔腸素。一種非常有用的低靈敏腔腸素。

Coelenterazine e

MX4611

體外水母發光蛋白再生中腔腸素e的速度最高,具有雙發射峰,分別為405nm和465nm,使其能在pCa 5-7范圍內通過雙發射峰熒光強度比率的方式測定Ca2+濃度,提高檢測準確度。但由于滲透性差,不適合胞內應用。在溶液中穩定性差。

 

腔腸素的訂購信息:

懋康生物提供非常全面的腔腸素及其衍生物產品,且有多重包裝形式供應,選擇性高。進口品質,保質保量,部分現貨供應。歡迎來電咨詢,電話:021-54736159,QQ:2971634497,1563822900。


腔腸素系列產品重要事項:

1. 腔腸素凍干粉需-20℃避光保存,且保存在惰性氣體下。

2. 溶于甲醇或乙醇,不可溶于DMSO。

3. 腔腸素儲存液不建議保存在-20℃或-70℃。因腔腸素是一種高能量的雙雜環丁酮環狀結構,即使在低溫下也會自發降解。


綜合以上的特征,我司懋康生物提供所有凍干粉產品都含惰性氣體保證其穩定性。且多以小包裝(50μg或500μg)的形式提供,以減少因單次使用不完造成的資源浪費。

貨號

名稱

規格                     

價格(元)           

MX4606-500UG         

Coelenterazine Native天然腔腸素                   

500μg

598

MX4606-1MG

Coelenterazine Native天然腔腸素

2×500μg

1018

MX4606-5MG

Coelenterazine Native天然腔腸素

5mg

2398

MX4606-10MG

Coelenterazine Native天然腔腸素

10mg

3598

MX4608-500UG

Coelenterazine h腔腸素h

500μg

928

MX4608-1MG

Coelenterazine h腔腸素h

2×500μg

1468

MX4610-500UG

Coelenterazine 400 a腔腸素400a

500μg

828

MX4610-1MG

Coelenterazine 400 a腔腸素400a

2×500μg

1380

MX4611-500UG

e-Coelenterazine腔腸素e

500μg

928

MX4611-1MG

e-Coelenterazine腔腸素e

2×500μg

1468

MX4612-500UG

Coelenterazine f腔腸素f

500μg

928

MX4613-250UG

Coelenterazine cp腔腸素cp

250μg

1482

MX4614-250UG

Coelenterazine hcp腔腸素hcp                            

250μg                 

1482

MX4615-50UG

Coelenterazine n腔腸素n

50μg

1160

MX4615-250UG

Coelenterazine n腔腸素n

250μg

3384


體內注射用腔腸素產品:

我司(懋康生物)特別提供專門用于體內動物實驗研究用的注射用腔腸素產品。粉末不僅純度非常高,且提供特別溶劑以增強粉末的溶解能力。

貨號

名稱

規格                 

價格(元)      

MX4607-1MG         

Injectable native Coelenterazine 注射用天然腔腸素        

2×500μg

1698

MX4607-5MG

Injectable native Coelenterazine 注射用天然腔腸素

10×500μg

5729

MX4607-10MG

Injectable native Coelenterazine 注射用天然腔腸素

20×500μg

10800

MX4609-1MG

Injectable h-Coelenterazine 注射用腔腸素h

2×500μg

1898

MX4609-10MG

Injectable h-Coelenterazine 注射用腔腸素h

20×500μg

10800

 

應用示例【生物化學發光體內成像】

 

Fig. In vivo visualization of mitochondrial Ca2+uptake in the hindlimb muscle after stimulation of the sciatic nerve. (A) Direct visualization of Ca2+-induced bioluminescence in the hindlimb muscle after tetanic stimulation of the sciatic nerve (5 ms pulses at 50 Hz for 2.5 s). Each frame represents 1 s of light accumulation superimposed with the video image taken before the acquisition of bioluminescence. The FOV was 16×12 cm. Smoothing has been applied to the bioluminescent image overlay to a resolution of 1 mm. Color scale is in photons/pixel/s. (B) Mice were injected (i.v) with native coelenterazine (4 mg/kg) and Ca2+-induced light emission was recorded immediately after in the hindlimb muscles in response to tetanic stimulations applied every 2 minutes over more than 1.5 hours. The plot shows the increasing amplitude of the light response (photons/s) as a function of time.【文獻來源:Non-Invasive In Vivo Imaging of Calcium Signaling in Mice. PMC1991622】

 

注意事項

1)所有產品僅供科研用途,不可用做臨床或診斷用途。

2)為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 

 

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】


 

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學和生物技術領域研究的試劑、儀器和實驗室消耗品與實驗服務工作,主要從事細胞生物學、植物學、分子生物學、免疫學、生物化學、蛋白組學。生物制藥與診斷試劑研發生產等領域。 本公司秉承“以人為本,以誠為信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為廣大客戶提供優質產品。


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