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酵母雙雜交檢測(Yeast Two-Hybrid Assay)產品專題
時間:2017-04-06     作者:懋康原創     文章來源:懋康生物    

檢測原理:

酵母雙雜交系統(Yeast two-hybrid assay)是用于體內研究蛋白相互作用的一種非常便利的工具,常用的如GAL4為基礎的系統,使用酵母轉錄因子GAL4來檢測轉錄激活后的蛋白相互作用。某些轉錄因子(如GAL4)由兩個可以分開,功能上相互獨立的結構域組成,N端有一個147個氨基酸組成的DNA結合域(DNA binding domain,BD),C端有一個由113個氨基酸組成的轉錄激活域(transcription activation domain,AD)。BD可以和上游激活序列(UAS)結合,而AD能激活UAS下游基因進行轉錄。單獨的BD或AD不能激活基因轉錄,兩者只有通過某種方式結合在一起形成完整的轉錄激活因子的功能【見圖1】。酵母雙雜交系統主要利用酵母GAL4的這個特性通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結合及對報告基因的轉錄激活來研究活細胞內蛋白質的相互作用,對蛋白質之間微弱、瞬間的作用都能通過報告基因敏感的檢測到。

 

酵母雙雜交系統應用:

  1. 對新的與已經蛋白相互作用的鑒定

  2. 對預測蛋白相互作用的確認

  3. 對蛋白相互作用區域的鑒定

 

圖1. 雙雜交檢測原理圖。兩個蛋白分別表達,一個(誘餌蛋白bait protein)融合到Gal4 DNA結合域表達,另一個(誘捕蛋白prey protein)融合到Gal4轉錄激活結構域(AD)表達。在Y2HGold酵母菌株中,只有當兩個蛋白之間相互作用并結合到Gal4反應性啟動子上才能活化報告基因(AUR1-C, ADE2, HIS3,和MEL1)的表達。

 

酵母雙雜交系統重要元件介紹(以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例)

1、誘餌(the bait)

為了建立GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白,推薦使用質粒pGBKT7;

要調查三元蛋白復合物,推薦使用含2個MCS區域的三雜交載體,能表達GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白和第二個感興趣蛋白,在bait和prey蛋白之間發揮橋梁作用。


2、檢測蛋白作用的四個報告基因

Matchmarker gold系統是采用4個報告基因/3個不同bait識別序列的雙雜交系統(見圖2)。其采用新型穩定的酵母雙雜交抗生素-金擔子素Aureobasidin A(AbA)(貨號:MS0002-1ML),可有效殺死非抗性克隆,從而大大降低背景克隆生長。同時有效縮減假陽性,由于人和prey蛋白單獨將結合引起假陽性都需要識別3個不同序列,激活4個報告基因的表達。

4個報告基因分別是:1個AbA抗生素篩選報告基因,2個營養篩選報告基因,1個藍白斑篩選報告基因。

1)AUR1-C

AUR1基因的主要突變版,能夠表達肌醇磷脂酰神經酰胺合成酶(Inositol phosphorylceramide (IPC) synthase)。當蛋白發生作用促使GAL4轉錄激活,AUR1-C基因進行表達。釀酒酵母中此基因的表達孵育其對高毒抗生素金擔子素Aureobasidin A(AbA)的抗性。由于其背景極其低,這一篩選報告子優于單一的營養缺陷報告子。


2)HIS3

Y2HGold菌株不能合成組氨酸,從而無法在缺少這一必須氨基酸的培養基上生長。當誘餌和誘捕蛋白相互作用,Gal4反應性的His3表達促使細胞合成組氨酸并能在His缺陷培養基上生長。


3)ADE2

Y2HGold菌株無法在不含腺嘌呤的基本培養基上生長,但當兩個蛋白相互作用,Ade2表達被活化,細胞能在Ade缺陷的基礎培養基上生長。


4)MEL1

MEL1編碼α-半乳糖苷酶,存在許多酵母菌內的天然表達蛋白。當雙雜交發生,MEL1表達和分泌,在底物X-α-Gal(貨號:MF2003-25MG)存在的情況下,酵母菌落變為藍色。


3、三個不同的結合位點(three different binding sites)

Y2HGold菌株三個啟動子控制4個報告基因是不相關的,除UAS區域的短蛋白結合位點特異性結合Gal4 DNA-BD。因此,誘捕蛋白(文庫蛋白或靶蛋白)與UAS內部或邊緣的不相關序列作用(假陽性)就會自動被篩查出來。

圖2. Matchmarker酵母菌株的報告基因構造。Y2HGold中,HIS3,ADE2,MEL1,和AUR1-C報告基因分別由三個完全異源的Gal4反應啟動元件-G1,G2,M1操控。而啟動子內的蛋白結合位點是不同的,雖然每一個結合位點與Gal4識別的17-mer共有序列相關聯。


酵母雙雜交系統操作流程(以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例)

完整的Matchmarker篩選過程包含以下步驟:

第一步:執行對照實驗;

第二步:誘餌載體的構建及自我激活和毒性檢測;

第三步:篩選Mate&Plate文庫

第四步:確認和闡釋結果

圖3.使用Mate&Plate文庫進行雙雜交篩選。捕獲蛋白(bait protein)是酵母菌Y2HGold表達的Gal4 DNA-BD融合蛋白。高復雜性文庫表達Gal4 AD融合蛋白,由Y187酵母菌提供。當兩種轉化菌株混合過夜能接合產生二倍體(Diploids)。此二倍體含有4個報告基因:HIS3,ADE2,MEL1和AUR1-C,受雙雜交作用而活化表達。

 

酵母雙雜交檢測需要產品信息:

我司(懋康生物)提供酵母雙雜交研究需要的一系列產品,從酵母菌株、酵母質粒、酵母培養基到篩選標志(抗生素),歡迎來電咨詢。

一、富集培養基(Rich Medium酵母培養)

貨號                           

名稱                                                               

規格                   

價格(元)     

MS6301-350G

YPD Agar Medium YPD瓊脂培養基

350g

550

MS6302-250G

YPD Medium YPD液體培養基

250g

438

MS6303-350G

YPDA Agar Medium YPDA瓊脂培養基

350g

550

MS6304-250G

YPDA Medium YPDA液體培養基

250g

438

【補充描述】:

1)YPD是用于大多數酵母菌生長所需的酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖優化配比后組成的混合物;

2)YPDA培養基是在YPD基礎上添加硫酸腺嘌呤,終濃度120 μg/ml。


二、基本培養基(Minimal Medium酵母培養)

貨號               

名稱                                 

規格     

價格(元)

MS6311-467G

Minimal SD Agar Base SD瓊脂基礎培養基

467g

1428

MS6312-267G

Minimal SD Base SD基礎培養基

267g

768

MS6313-270G

Minimal SD Agar Base Gal/Raf SD瓊脂基礎培養基(含半乳糖/棉子糖)

270g

1428

MS6314-185G

Minimal SD Base Gal/Raf SD基礎培養基(含半乳糖/棉子糖)

185g

988

【補充描述】:

1)SD Medium:酵母菌用的基本的合成限定培養基(Minimal synthetically defined medium),包含氮源,碳源(葡萄糖,除非有特殊說明)和DO添加劑(Dropout Supplement)。

2)DO(Dropout Supplement or Solution):特定氨基酸和核苷的混合物,添加到SD base內以配制SD Medium。DO缺少一種或者更多未轉化酵母菌需要的營養成分使其在SD Medium上生長,作為營養篩選標志。 



三、省卻成分氨基酸混合物(DO Supplements 酵母培養)

類型

名稱

貨號

規格          

價格(元) 

Single Dropout Supplements (SDO)

單一省卻成分添加劑

DO Supplement -His

MS6316-10G    

10g

418

DO Supplement -Leu

MS6317-10G

10g

418

DO Supplement -Trp

MS6318-10G

10g

418

DO Supplement -Ura

MS6319-10G

10g

418

Double Dropout Supplements (DDO)

雙省卻成分添加劑

DO Supplement -His/-Leu

MS6320-10G

10g

418

DO Supplement -His/-Ura

MS6321-10G

10g

418

DO Supplement -Leu/-Trp

MS6322-10G

10g

418

DO Supplement -Met/-Trp

MS6323-10G

10g

418

DO Supplement -Trp/-Ura

MS6324-10G

10g

418

DO Supplement -Trp/-His

MS6325-10G

10g

418

DO Supplement -Ura/-Leu

MS6326-10G

10g

418

Triple Dropout Supplements (TDO)

三省卻成分添加劑

DO Supplement -His/-Leu/-Trp

MS6331-10G

10g

418

DO Supplement -His/-Leu/-Ura

MS6332-10G

10g

418

DO Supplement -His/-Trp/-Ura

MS6333-10G

10g

418

DO Supplement -Leu/-Met/-Trp

MS6334-10G

10g

418

DO Supplement -Leu/-Trp/-Ura

MS6335-10G

10g

418

DO Supplement -Trp/-His/-Ade

MS6336-10G

10g

418

Quadruple Dropout Supplements (QDO)  

四省卻成分添加劑 

DO Supplement -Ade/-His/-Leu/-Trp   

MS6341-10G

10g              

418

DO Supplement -His/-Leu/-Met/-Trp

MS6342-10G

10g

418

DO Supplement -His/-Leu/-Trp/-Ura

MS6343-10G

10g

418


四、酵母營養缺陷完全培養基(SD+DO Supplments)

類型

名稱

貨號

規格              

價格(元)    

SD + DO Broth 

酵母缺陷型完全培養基(肉湯)          

SD/-His Broth

MS6361-5L          

5L

838

SD/-Leu Broth

MS6363-5L

5L

838

SD/-Trp Broth

MS6365-5L

5L

838

SD/-Ura Broth

MS6367-5L

5L

838

SD/-His/-Leu Broth

MS6381-5L

5L

838

SD/-His/-Ura Broth

MS6383-5L

5L

838

SD/-Leu/-Trp Broth

MS6385-5L

5L

838

SD/-Met/-Trp Broth

MS6387-5L

5L

838

SD/-Trp/-Ura Broth

MS6389-5L

5L

838

SD/-Trp/-His Broth

MS6391-5L

5L

838

SD/-Trp/-Ade Broth

MS6393-5L

5L

838

SD/-Ura/-Leu Broth

MS6395-5L

5L

838

SD/-His/-Leu/-Trp Broth

MS6411-5L

5L

838

SD/-His/-Leu/-Ura Broth

MS6413-5L

5L

838

SD/-His/-Trp/-Ura Broth

MS6415-5L

5L

838

SD/-Leu/-Met/-Trp Broth

MS6417-5L

5L

838

SD/-Leu/-Trp/-Ura Broth

MS6419-5L

5L

838

SD/-Trp/-His/-Ade Broth

MS6421-5L

5L

838

SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp Broth        

MS6431-5L

5L

838

SD/-His/-Leu/-Met/-Trp Broth

MS6433-5L

5L

838

SD/-His/-Leu/-Trp/-Ura Broth

MS6435-5L

5L

838

SD + DO with Agar 

酵母缺陷型完全培養基(瓊脂)

SD/-His with Agar

MS6362-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Leu with Agar

MS6364-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Trp with Agar

MS6366-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Ura with Agar

MS6368-5L

10×0.5 L

1078

SD/-His/-Leu with Agar

MS6382-5L

10×0.5 L

1078

SD/-His/-Ura with Agar

MS6384-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Leu/-Trp with Agar

MS6386-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Met/-Trp with Agar

MS6388-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Trp/-Ura with Agar

MS6390-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Trp/-His with Agar

MS6392-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Trp/-Ade with Agar

MS6394-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Ura/-Leu with Agar

MS6396-5L

10×0.5 L

1078

SD/-His/-Leu/-Trpwith Agar

MS6412-5L

10×0.5 L

1078

SD/-His/-Leu/-Urawith Agar

MS6414-5L

10×0.5 L

1078

SD/-His/-Trp/-Urawith Agar

MS6416-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Leu/-Met/-Trpwith Agar

MS6418-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Leu/-Trp/-Urawith Agar

MS6420-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Trp/-His/-Adewith Agar

MS6422-5L

10×0.5 L

1078

SD/-Ade/-His/-Leu/-Trpwith Agar

MS6432-5L

10×0.5 L

1078

SD/-His/-Leu/-Met/-Trpwith Agar

MS6434-5L

10×0.5 L

1078

SD/-His/-Leu/-Trp/-Urawith Agar

MS6436-5L

10×0.5 L

1078



、篩選抗生素(底物)

貨號

名稱

規格            

價格(元) 

MS0002-1ML

Aureobasidin A(AbA)金擔子素A(1 mg/ml)

1ml

900

MF2003-25MG

X-α-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷

25mg

285

MF2001-1G

X-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷

1g

280

MF2522-500MG   

5-Fluoroorotic acid monohydrate (5-FOA) 5-氟乳清酸一水合物       

500mg

316

【補充描述】:

1)Aureobasidin A(AbA)金擔子素A是報告基因AUR1-C的篩選抗生素,以判斷酵母菌是否能表達賦予其AbA抗性的酶。

2)X-α-Gal是α-半乳糖苷酶(由MEL1基因編碼)的底物,當雙雜交發生時MEL1報告基因正常表達催化底物發生顏色反應,使得酵母菌落呈藍色。

3)X-Gal是?-半乳糖苷酶(由lacz基因編碼)的底物。

4)5-FOA(5-氟乳清酸)酵母反篩選(counter-selection)底物,常用于釀酒酵母(URA3)的鑒定和篩選。


、酵母質粒提取試劑盒

貨號             

名稱                                                                                    

規格          

價格(元)  

D3376-01

酵母質粒抽提試劑盒Yeast Plasmid Kit(Omega Biotek)

50次

495

【試劑盒工作原理】:

該試劑盒把硅膠柱純化技術同經典的SDS堿裂解法結合起來,用戶可在1小時內從酵母培養液中純化出高純度的質粒DNA。純化過程不需用任何到有害的有機物抽提,亦不需用到耗時的乙醇沉淀。質粒DNA的產量依賴于酵母攜帶質粒的拷貝數,酵母菌株以及生長條件。一般來說,酵母質粒的拷貝數較低,5.0ml過夜培養液中質粒DNA產量約為1.0 μg左右。純化的質??芍苯佑糜诿盖?,PCR,電轉化等應用。酵母收集后,加入破壁酶和玻璃珠去除細胞壁,用傳統堿裂法裂解細胞,然后將獲得的上清液轉移至結合柱結合DNA,經過兩次快速洗滌,最后用無菌水洗脫出質粒DNA。 


、酵母轉化試劑盒

貨號

名稱

規格             

價格(元)  

MF2501-200T    

Yeast Transformation Kit 酵母轉化試劑盒

200T

768

T2001

Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit 酵母轉化試劑盒    

120 Rxns

1246

【補充描述】:

酵母質粒轉化試劑盒,含PEG/liAC酵母轉化需要的所有試劑,操作簡單,轉化效率高。 


、酵母雙雜交菌和感受態細胞

貨號                 

名稱                                                                                

規格          

價格(元)

MF2351-300UL

Y2HGold Yeast Strain 酵母雙雜交用甘油菌

300μl

咨詢

MF2352-100UL

Y2HGold Chemically Competent Cell 酵母菌化學感受態細胞

100μl

咨詢

MF2353-300UL

Y187 Yeast Strain 酵母雙雜交用甘油菌

300μl

咨詢

MF2354-100UL

Y187 Chemically Competent Cell 酵母菌化學感受態細胞

100μl

咨詢


、酵母菌載體

貨號               

名稱                                                                            

規格            

價格(元)    

MF3601-20UL

pGBKT7 DNA-BD Vector 酵母雙雜交克隆載體

20μl

咨詢

MF3602-20UL

pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對照載體

20μl

咨詢

MF3603-20UL

pGBKT7-Lam Vector  酵母雙雜交對照載體

20μl

咨詢

MF3604-20UL

pGADT7-AD Vector 酵母雙雜交克隆載體

20μl

咨詢

MF3605-20UL

pGADT7-T Vector酵 母雙雜交對照載體

20μl

咨詢

MF3606-20UL

pBridge Vector 酵母三雜交克隆載體

20μl

咨詢

MF3609-20UL

pGBT9 Vector 酵母雙雜交克隆載體

20μl

咨詢

 

 

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

 

 

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學和生物技術領域研究的試劑、儀器和實驗室消耗品與實驗服務工作,主要從事細胞生物學、植物學、分子生物學、免疫學、生物化學、蛋白組學。生物制藥與診斷試劑研發生產等領域。 本公司秉承“以人為本,以誠為信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為廣大客戶提供優質產品。

 

K
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