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Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit 細胞凋亡檢測試劑盒
目錄號 MX3210-50T 售價 1050.00元
規格 50T 運輸溫度 冰袋運輸
其他名稱 保存溫度 2-8℃保存,不可冰凍 其中組分A,B需避光保存
CAS號 N/A 有效期 1年有效
應用 訂購數量
產品簡介:

Annexin V- FITC/PI Apoptosis Detection Kit

細胞凋亡檢測試劑盒

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產品信息

產品名稱

產品編號

規格                 

價格(元)   

Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit      

細胞凋亡檢測試劑盒

MX3210-20T             

20T

650 特價:600

MX3210-50T

50T

1350  特價:1050

MX3210-100T

100T

1980  特價:1580

 

產品描述

Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit)是一款用來檢測細胞凋亡的試劑盒,可以用流式細胞儀或熒光顯微鏡進行檢測。本試劑盒包含FITC標記的Annexin V,用來檢測早期細胞凋亡;以及碘化丙啶(PI),用來檢測壞死細胞。

 

本試劑盒的工作原理在于:磷脂酰絲氨酸(Phosphotidylserine,PS)是一種帶負電荷的磷脂。正常細胞中,PS位于細胞膜內面,但當凋亡開始后,PS在磷脂雙分子層中的不對稱分布逐漸消失并轉移到細胞膜表面,從而暴露在細胞外環境中。膜聯蛋白V(Annexin V)是一種分子量約35kDa的鈣離子依賴性磷脂結合蛋白,能非常容易的結合PS,且具有高度的親和性。因此,通過Annexin V與PS的結合與否來判斷凋亡發生。另外,PI的引入能輔助區分凋亡早期細胞和晚期凋亡或壞死細胞。PI作為一種活細胞排斥探針,不能穿透具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡早期細胞,但能穿透喪失細胞膜完整性的凋亡晚期細胞或壞死細胞,從而將細胞核染紅。因此,將Annexin V-FITC與PI聯合使用時,呈現結果為:正常細胞(Annexin V-FITC-/PI-),早期凋亡細胞(Annexin V-FITC+/PI-);晚期凋亡細胞和壞死細胞同時呈現雙陽性(Annexin V-FITC+/PI+)。

 

產品組成

組分編號

組分名稱

保存方法

產品編號(規格)

MX3210-20T

MX3210-50T

MX3210-100T

MX3210-A

Annexin V-FITC

2-8℃避光

100μl

250μl

500μl

MX3210-B

碘化丙啶溶液

2-8℃避光

200μl

500μl

1ml

MX3210-C

結合緩沖液(4×)

2-8℃

4ml

10ml

20ml

 

保存與運輸方法

保存:2-8℃保存,不可冰凍。其中組分A,B需避光保存。1年有效。

運輸:冰袋運輸。

 

注意事項

1) 由于細胞凋亡是一個快速過程,染色后請盡快檢測,時間過長會導致凋亡或壞死細胞數量增加。

2) 對于貼壁細胞,需要很好掌控消化步驟。細胞凋亡誘導時貼壁細胞如有漂浮細胞,需同時收集漂浮細胞和貼壁細胞合并染色。處理貼壁細胞時要小心,盡量避免人為造成的細胞損傷。胰酶消化時間過短,細胞需要用力吹打才能脫落,容易造成細胞膜的損傷,導致PI攝入過多;而胰酶消化時間過長,細胞膜也易造成損傷,甚至會影響細胞膜PS與Annexin V的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后,輕搖使胰酶與細胞充分接觸,之后倒掉大部分胰酶,利用殘留的少量胰酶再消化一段時間,待細胞間空隙增大,瓶底呈花斑狀即可終止。消化液中盡量不用EDTA,EDTA會影響Annexin V與PS的結合。


3) 實驗中若需固定細胞,比如凋亡檢測同時還需要檢測細胞周期,建議選用Annexin V-FITC,不要使用Annexin V-EGFP,因固定過程中EGFP會變性導致無熒光。

 

4) 若樣品來源于血液,務必先去除血液中的血小板。因為血小板含有PS,會與Annexin V結合產生假陽性??墒褂煤珽DTA的緩沖液并低速離心去除血小板。

 

5) 熒光物質易發生淬滅,試劑儲存和操作過程中盡量避光。熒光檢測時也盡量縮短觀察時間。

6) 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

一、 染色步驟

1.1 細胞樣品的準備:

a)對于貼壁細胞:小心收集細胞培養液到一干凈離心管內備用。 用不含EDTA的胰酶消化細胞至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,加入前面收集的細胞培養液,吹打下所有的貼壁細胞,并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000rpm離心5min,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果無法完全離心至管底,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清,可以殘留約50μl左右的培養液,以避免吸走細胞。加入1ml 4℃預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞,小心吸除上清。

 

b)對于懸浮細胞:1000rpm離心5min沉淀細胞。對于特定的細胞,如果無法完全離心至管底,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清,可以殘留約50μl左右的培養液,以避免吸走細胞。加入1ml 4℃預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞,小心吸除上清。

 

1.2 用去離子水按照1:3稀釋結合緩沖液到1×,比如,5ml結合緩沖液(4×)加入15ml去離子水。

1.3 用結合緩沖液(1×)重新懸浮細胞并調整濃度為1-5×106/ml。

1.4 取100μl的細胞懸液到5ml流式管中,加入5μl Annexin V-FITC混勻,室溫避光孵育5min。

1.5 再加入10μl碘化丙啶溶液,并加400μl結合緩沖液(1×),混勻,盡快(<1h)用流式細胞儀或熒光顯微鏡完成檢測。

 

【注意】:方便起見,步驟1.4內可同時加入5μl Annexin V-FITC和10μl碘化丙啶溶液混勻,室溫避光孵育5min。然后加入400μl結合緩沖液(1×)混勻,但需盡快(<1h)用流式細胞儀或熒光顯微鏡完成檢測。但為了減少實驗誤差,建議按照1.4-1.5的步驟來操作。因PI受時間影響比較大,細胞標記上PI后毒性會增加。隨著時間延長會導致PI染色增加,尤其是檢測早期凋亡時,誤差會明顯加大。建議PI加入后立即開始檢測。

 

二、 染色檢測

2.1流式細胞儀分析

1)請根據以下設計實驗:

空白管:陰性對照組細胞,不加Annexin V-FITC和碘化丙啶溶液。目的用來調節電壓。

單染管:陽性對照組細胞,只加Annexin V-FITC。目的用來調節補償。

檢測管:處理細胞組,加Annexin V-FITC和碘化丙啶溶液。用空白管和單染管調節好電壓補償后,獲得所需的流式數據。

 

2)對于Annexin V-FITC(Ex=488nm,Em=525nm),用流式細胞儀的FITC信號檢測器(通常F1通道);對于PI-DNA復合物(Ex=535nm,Em=615nm),用流式細胞儀的PE發射信號檢測器(通常F2通道)。

3)用CellQuest等軟件進行分析,繪制雙色散點圖(two-color dot plot),FITC為橫坐標,PI為縱坐標。每個樣采集10,000 events。典型實驗結果中,細胞可分成三個亞群,活細胞僅有很低強度的背景熒光,凋亡早期細胞僅有較強的綠色熒光,凋亡晚期細胞或壞死細胞有綠色和紅色的雙重熒光染色。

 

2.2熒光顯微鏡分析

1)滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細胞懸液于載玻片上,并用蓋玻片蓋上細胞?!咀⒁狻浚簩τ谫N壁細胞,可直接用蓋玻片培養細胞并誘導細胞凋亡。探針孵育結束后,可將蓋玻片倒置在載玻片上并進行觀察。需要在染色結束后盡快(<1h)進行觀察。

2)于熒光顯微鏡下用雙色濾光片(FITC/羅丹明)進行觀察。早期凋亡細胞,僅結合Annexin V-FITC的細胞質膜呈現綠色。而喪失膜完整的細胞在細胞核上被PI染色呈現紅色,且在細胞表面(質膜)上因被Annexin V-FITC染色呈綠色光環。

 

常見問題

1) Annexin V/PI凋亡試劑盒能夠用于檢測人或其他動物的細胞凋亡情況?

回復:可以,因Annexin V特異性結合PS,而PS在不同種屬間無差異。

 

2)貼壁細胞做凋亡用胰酶消化對細胞膜有損傷?

回復:低濃度胰酶消化,輕柔吹打貼壁細胞2~3次,4℃,1000rpm離心5min, 處理得當的話, 胰酶造成損傷可以控制在 5%以內,在有對照組的情況下對實驗結果不會造成明顯影響。

 

3)貼壁細胞可先染PI然后再消化嗎?這樣是否可減少由于消化液造成的細胞膜損傷而染上PI的誤差?

回復:先加 PI不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷, 而且PI本身對細胞也是有毒性的, 對實驗結果影響會比胰酶大,不建議這樣做。

 

4)為什么只能用不含 EDTA的胰酶消化貼壁細胞,用含 EDTA的胰酶消化細胞對結果有什么影響?

回復:因Annexin V是鈣離子依賴性的磷脂結合蛋白,EDTA是一種金屬螯合劑。因此EDTA的加入會影響Annexin V活性,進而影響結果。

 

相關產品

貨號

名稱

規格               

MX3210-20T           

Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit細胞凋亡檢測試劑盒

20T

MX3211-20T

Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit細胞凋亡檢測試劑盒              

20T

MX3212-20T

Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit細胞凋亡檢測試劑盒

20T

MX3213-20T

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit細胞凋亡檢測試劑盒

20T

MX3214-30T

Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Detection Kit  細胞凋亡檢測試劑盒 

30T

MX3215-20T

Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit細胞凋亡檢測試劑盒

20T

 

引用文獻

Hou Xy et al. A combination of LightOn gene expression system and tumor microenvironment-responsive nanoparticle delivery system for targeted breast cancer therapy. Acta Pharmaceutica Sinica B Available online 27 April 2020.


Cell-counting-kit 8 (CCK-8), Hoechst 33342, hyaluronidase (HAase) and annexin V-FITC/propidium iodide (PI) apoptosis detection kits were purchased from Shanghai Maokang Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). 4T1 cells (5 × 104 cells/well) were seeded into 6-well plates. After 24 h, the cells were treated with 4 μg of pGDTA (2 μg of pGAVPO and 2 μg of pU5-DTA). After incubation with or without exposure to blue light (2 W/m2) for 24 h, the cells were collected, washed, and stained with annexin V-FITC and propidium iodide (PI). The cells were analyzed for apoptosis using flow cytometry.


  


 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

 

 

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